***是否影響發育期**神經系統的正常發育一直是懸而未決而又具有重要意義的課題。傳統觀點推斷各種***在體內的短暫作用不會引起神經元及其連接的病理改變，但缺乏實驗觀察依據。相反，近年許多研究發現在腦發育的關鍵階段，動物神經元活性的短暫改變（過度激活或抑制）即可造成神經元形態和功能的異常，影響神經網絡的構建^{[1]N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑可引起不同腦區廣泛的凋亡性神經元退行性變。***是NMDA受體非竟爭性拮抗劑，臨床常用于小兒麻醉。麻醉、手術對學習記憶的影響已有研究}[2^，3]，但在發育早期***麻醉是否對空間辨別性學習記憶有遠期影響還鮮見報到。本研究采用神經功能學和**組織化學的方法擬觀察新生大鼠***麻醉后空間辨別學習能力和海馬突觸素的變化，為***的合理應用提供實驗依據。。腦爆發生長期應用改變神經元生理活性的

1.1動物及麻醉處理 新生1周Wister大鼠30只，體重18～20g，由西安第四軍醫大學實驗動物中心提供。隨機均分為三組，每組10只。生理鹽水組（N組）：給予與***同體積生理鹽水；K100組和K50組麻醉誘導時分別腹腔注射***100mg/kg和50mg/kg，以后每小時追加首劑量的1/2，維持麻醉6h。大鼠平臥在自制的麻醉箱中實施麻醉，同時用嬰兒脈搏血氧飽和度探頭貼于小鼠腹部，監測Sp0₂和HR，以防止麻醉過深所致大鼠腦缺氧，采集尾部血，用i-STAT型血氣分析儀（雅培公司，美國）行血氣分析均正常（距幼鼠尾3mm處剪斷鼠尾采血）。幼鼠麻醉結束后與母鼠同窩飼養。

1.21曠場實驗 曠場行為觀察箱為60cm×60cm×60cm的無頂木箱,箱底用墨線分為36個等份小方格。麻醉后3周大鼠自中央格放入，觀察在中央格停留時間和2min內穿越的格子數。

1.22Morris水迷宮實驗 morris水迷宮為一直徑1.2ｍ、高0.5ｍ圓桶，劃為四個象限，盛水后按0.5%～1.5%比例加入奶粉，使水成不透明乳白色，水溫控制于22～25℃。將一直徑10cm平臺固定于某一象限，平臺在水平面下1cm。麻醉后16d開始水迷宮試驗。程序包括①定位航行試驗歷時5d，每天上下午各4次，將大鼠從4個入水點面向池壁放入水中，記錄2min內尋找平臺的時間(逃避潛伏期)；②空間探索試驗，將鼠任選一入水點放入水中，測其2min內在原平臺處停留時間。整個認知功能測試過程中，保持實驗室內燈光、物品擺放等室內環境一致，以排除環境干擾。

1.31動物取材 認知功能測試完畢后立即將大鼠開胸，經左心室至升主動脈插管，先以100ml生理鹽水沖洗血液，隨后用冷的（4℃）含40g/L多聚甲醛的0.1M磷酸鹽緩沖液（pH7.4）先快后慢灌流固定2h，取腦置于300g/L蔗糖中（4℃）直至組織沉底，冰凍切片機連續冠狀切片，片厚30μm，切片分套，置于0.01MPBS中存放。

1.32**染色 取1套切片在0.01M PBS中漂洗后，入含0.3%Triton X-100的0.01MPBS中浸泡30min（室溫）。然后進行**組織化學熒光染色：加入突觸素I抗（1：500，Santa Cruz公司 美國）孵育24h（室溫，在濕盒內）。在0.01MPBS液中漂洗3次，每次5min。加入熒光II抗（1：200，Chemicon公司 美國）閉光孵育2h.室溫避光孵育2h。0.01 mol/L PBS洗3次，80%甘油封片，Confocal共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖象, 用Image J 圖象處理軟件（NIMH公司，美國）進行分析，以熒光半定量OD值來表示突觸素的表達水平。 

1.4統計學分析 定量數據以均數±標準差（）表示。采用SPSS10.0統計軟件進行多組均數比較的方差分析及均數間的兩兩比較,用t檢驗，P≤0.05為差異有顯著性統計學意義。

2結    果

2.1***麻醉對新生大鼠神經行為學的影響 各組大鼠在曠場中央格的停留時間及穿越的方格數無顯著差異（P>0.05）。 水迷宮測試K₁₀₀和K₅₀組的逃逸潛伏期均明顯高于N組（P<0.05），尋找到平臺的時間較長，經訓練提高較慢。探索時間K₁₀₀和K₅₀組短于N組（P<0.05），大鼠常在四個象限無目的漫游。K₁₀₀組和K₅₀組之間差異無顯著意義（表1）。

2.2***麻醉對新生大鼠海馬SYN表達的影響 本實驗顯示: 正常狀態下,SYN在海馬CA_1、、CA₂和CA₃區呈現綠色熒光，N組的綠色熒光強度較弱，K₁₀₀組和K₅₀組的熒光強度較N組強，它們的OD值見（表1）。  

3討    論

突觸素是一種相對分子量為38×10³ 的鈣結合糖蛋白,特異性位于軸突終末端的突觸前囊泡膜上,是一種重要的囊泡膜標志蛋白^[4]。突觸素參與乙酰膽堿、谷氨酸等神經遞質的釋放過程, 與突觸可塑性關系密切。突觸可塑性是突觸對內外環境變化作出反應的能力，是學習記憶的神經生物學基礎^[5]。研究認為，突觸素一方面通過對突觸結構的影響，另一方面通過其磷酸化作用調節神經遞質的釋放，從而在突觸可塑性中起一定作用。突觸素影響突觸可塑性的觀點，已為大多數學者所接受，但是Spillance 等^[6]采用突觸素基因敲除的小鼠卻發現，突觸素對于海馬兩種不同形式的長時程增強(Long-time potention,LTP)的誘導或表達和由蛋白激酶激活而引起的神經遞質釋放的增加都不是必需的，認為突觸素并不是長時程增強的必需成分，morris水迷宮而LTP介導了突觸可塑性的發生，與學習記憶密切相關，Rosahl等^[7]研究也認為突觸素并不是神經突起長出、突觸發生和突觸囊泡交換所必需的。多種影響學習記憶功能的因素可能與突觸素及其磷酸化水平的改變密切相關。但突觸素作用的機制仍存在一些爭議，有待進一步深入研究。

  Morris水迷宮是一種研究與海馬功能直接相關的空間學習記憶模型。逃逸潛伏期表明獲取空間信息的能力，而探索時間表明記憶儲存及提取再現能力。本研究結果表明,***麻醉新生1周大鼠（麻醉大鼠所需***的濃度為50mg/kg～100mg/kg），在麻醉后3周觀察到麻醉大鼠水迷宮逃逸潛伏期延長，探索時間縮短，提示麻醉大鼠與未麻醉大鼠的空間辨別學習和記憶能力出現下降。**組織化學表明***可上調海馬突觸素表達，.而Calhoun等^[8]研究卻發現，老年大鼠海馬齒狀回區突觸顆粒數量與大鼠在水迷宮的作業成績有顯著相關性。用人參皂甙對大鼠行腹腔注射，可使其海馬突觸素表達增強，在Morris水迷宮中的空間學習能力提高^9]。這些研究均提示學習記憶與突觸素的含量呈正相關性，而在本試研條件下卻發現，突觸素表達上調，而大鼠認知功能卻降低，與以往的研究結果相矛盾，因此，本研究認為，***導致大鼠認知功能下降的主要因素:（1）神經元大量凋亡,既往研究表明，在哺乳類神經突觸發生的關鍵期（大鼠生后2周內），注射NMDA受體拮抗劑AP₅和MK-801可導致神經細胞出現異常軸突側枝以及廣泛的神經變性、凋亡^10]。猴如果在出生后2周內阻斷NMDA受體，可出現大量凋亡性神經降解^[11]。（2）NMDA受體表達增強。NMDA受體是離子型谷氨酸受體的一種。原位雜交證實NMDA受體阻斷劑MK-801和***增加新生大鼠NR1/NR_2A、抑制NR1/NR_2B的重組表達，引起受體結構的變化。同時，本試研室研究還發現，***可上調海馬NMDAR₂及谷氨酸轉運體(GLAST)表達^[12]，而NMDA受體的上調表達能導致神經興奮性毒性增加，從而影響其學習記憶功能。由于突觸素通過其磷酸化作用調節神經遞質的釋放，相反NMDAR₂表達上調是否可引起突觸素表達上調，這種猜測將是我們下一步研究方向。

綜上所述，***可降低新生大鼠認知功能，并上調海馬突觸素的表達。
更多實驗方法請參考博客：blog.sina.com.cn/softmaze和公司網站：r24166.cn。